Identyfikacja wirusów roślin

vegetables-607307__180Identyfikacja wirusów roślin, a co za tym idzie i diagnozowanie choroby wirusowej możliwe są przy zastosowaniu metod roślin wskaźnikowych, metod serologicznych oraz technik elektronomikroskopowych.  W mikroskopie elektronowym ustala się przede wszystkim następujące cechy i własności wirusów: morfologię cząstek, ich właściwości serologiczne i pokrewieństwo z innymi wirusami oraz zmiany cytopatologiczne, jakie powstają na skutek porażenia danym wirusem. Do tego celu wykorzystuje się techniki do badań zawiesin wirusów w kontrastowych, negatywowo nieczyszczonych i oczyszczonych preparatach oraz techniki immunoelektronomikroskopowe. Umożliwiają one serologiczne wykrywanie wirusów występujących w bardzo niskich koncentracjach, wykrywanie mieszanin wirusów, a także przez możliwość mianowania surowic dokładnie określanie pokrewieństwa serologicznego. Specjalne znaczenie diagnostyczne mają wyniki badań interakcji wirus – roślina w ultracienkich skrawkach, a zwłaszcza badania inkluzji wirusowych.  1) Techniki elektronomikroskopowe w badaniach negatywowo kontrastowych preparatów in vitro wirusów roślin.   Preparaty in vitro wirusów to zawiesiny wirusów otrzymywane z soku roślin porażonych i te właśnie nadają się na preparaty elektronomikroskopowe. Aby cząstki wirusa były widoczne na błonce siateczki mikroskopu, muszą być wykontrastowane w stosunku do podłoża. W tym celu wykorzystywano techniki cieniowania, napylania wirionów ciężkimi metalami, które obecnie zastąpiono procedurami negatywowego kontrastowania preparatów. Tło staje się ciemniejsze a cząstki wirionów pozostają jaśniejsze. Do technik barwienia negatywowego preparatów in vitro należą:  – technika „mieszania EM” –  opracowana przez Williamsa i Backusa w 1949 roku. Polega ona na zmieszaniu preparatu zawierającego wirusa i barwnika w jednakowej objętości i pozostawieniu jej na siatce do wyschnięcia.  – technika zanurzania (dip) zwana zamiennie techniką szybkiego zanurzania (quick-dip) lub zanurzania liścia (leaf-dip) – opracowana przez Brandesa w 1957. Zasada techniki opiera się na tym, że krawędź świeżo przeciętego liścia lub fragment epidermy przeciągany jest kilka razy przez krople wody na szkiełku podstawowym. Część uszkodzonych komórek tonie w kropli, część pozostaje w postaci filmu na powierzchni kropli. Na kroplę nakłada się siateczkę i następnie kontrastuje. Technika ta przeznaczona była do wykrywania wirusów nitkowatych, ale Kitajima (1965), Hitchborn i Hills (1965) oraz Doi i wsp. (1969) wykrywali nią również izomeryczne winiony. Głównym problemem tej metody są zanieczyszczenia zaciemniające obrazy mikroskopowe.  technika zanurzania w soku (sap-dip) – technika ta wykorzystuje efekt adsorbowania cząstek wirusa na błonkach podtrzymujących. Błonki takie mogą być spłukiwane w celu usunięcia większości roślinnych zanieczyszczeń.

Preparaty antywirusowe

summer-861865__180Preparaty uzyskuje się przez nałożenie siateczki na krople soku lub odwrotnie po chwili spłukuje się ją wodą destylowaną i następnie kontrastuje. Zaleta metody jest to, że uzyskuje się wyraźniejsze obrazy morfologii cząsteczek, a wadą to, że jakiś ważny materiał może zostać wypłukany. Wykorzystując tę technikę Christie i wsp. (1987) opracowali procedurę CVC (clarifield viral concentrate) stosując wstępne oczyszczanie wirusa przed naniesieniem go na błonkę. Oprócz naprawdę czystych preparatów uzyskali, wielokrotne zwiększenie ilości cząstek wirusowych.  – technika „napięcia powierzchniowego” EM zwana „procedurą  rozszerzania” –  wykorzystuje napięcie powierzchniowe kropli wody, aby usunąć z preparatów sole i cukry czyli związki rozpuszczalne w wodzie. Białka i tłuszcze mogą pozostać na powierzchni kropli. Do powierzchni kropli dotyka się błonką siatki, a następnie kontrastuje. Służy ona w preparatyce kwasów nukleinowych  w ME. – technika „agarowa EM” – opisał ją  Kellenberger i Bitterli w 1976 roku. W technice tej błonkę podtrzymującą umieszcza się na płytce Petriego, a następnie nanosi się na nią zawiesinę wirusa. Drobne cząsteczki soli i cukrów powinny przeniknąć do agaru. Błonkę wypłukuję się barwnikiem z agaru i umieszcza na siatkach.    2) Techniki immunoelektronomikroskopowe preparatów in vitro.    Badanie reakcji serologicznych między antygenem (wirus roślinny) a specyficznymi przeciwciałami surowicy z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej możliwe jest dzięki tak zwanym technikom immunoelektronomikroskopowym – IEM. Techniki immunocytochemiczne umożliwiają lokalizację antygenów w komórkach roślin, za pomocą znakowanych elementarnym złotem przeciwciał. Bardzo wysoka czułość i specyficzność testów, minimalna wielkość próbek badawczych i w zasadzie możliwość wykorzystania prawie każdego rodzaju surowic to najważniejsze zalety tych technik.  – technika IEM dekoracji cząstek –  opracowana przez Milne i Luisoni w 1975 roku. Na skutek niespecyficznej adsorpcji cząstki wirusowe są unieruchamiane na powierzchni błonki podtrzymującej. Potraktowanie takich nieruchomych cząsteczek specyficzną surowicą prowadzi do wystąpienia reakcji serologicznej widocznej po kontrastowaniu w postaci opłaszczenia. Warstwa ta pochłania dużo więcej barwnika toteż jest widoczna jako ciemna otoczka. Poszczególne etapy procedury rozdzielone są dokładnym płukaniem siatek, dzięki czemu obrazy elektronomikroskopowe są bardzo wyraźne, dobrze wykontrastowane, bez nadmiaru zanieczyszczeń.