Preparaty antywirusowe

summer-861865__180Preparaty uzyskuje się przez nałożenie siateczki na krople soku lub odwrotnie po chwili spłukuje się ją wodą destylowaną i następnie kontrastuje. Zaleta metody jest to, że uzyskuje się wyraźniejsze obrazy morfologii cząsteczek, a wadą to, że jakiś ważny materiał może zostać wypłukany. Wykorzystując tę technikę Christie i wsp. (1987) opracowali procedurę CVC (clarifield viral concentrate) stosując wstępne oczyszczanie wirusa przed naniesieniem go na błonkę. Oprócz naprawdę czystych preparatów uzyskali, wielokrotne zwiększenie ilości cząstek wirusowych.  – technika „napięcia powierzchniowego” EM zwana „procedurą  rozszerzania” –  wykorzystuje napięcie powierzchniowe kropli wody, aby usunąć z preparatów sole i cukry czyli związki rozpuszczalne w wodzie. Białka i tłuszcze mogą pozostać na powierzchni kropli. Do powierzchni kropli dotyka się błonką siatki, a następnie kontrastuje. Służy ona w preparatyce kwasów nukleinowych  w ME. – technika „agarowa EM” – opisał ją  Kellenberger i Bitterli w 1976 roku. W technice tej błonkę podtrzymującą umieszcza się na płytce Petriego, a następnie nanosi się na nią zawiesinę wirusa. Drobne cząsteczki soli i cukrów powinny przeniknąć do agaru. Błonkę wypłukuję się barwnikiem z agaru i umieszcza na siatkach.    2) Techniki immunoelektronomikroskopowe preparatów in vitro.    Badanie reakcji serologicznych między antygenem (wirus roślinny) a specyficznymi przeciwciałami surowicy z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej możliwe jest dzięki tak zwanym technikom immunoelektronomikroskopowym – IEM. Techniki immunocytochemiczne umożliwiają lokalizację antygenów w komórkach roślin, za pomocą znakowanych elementarnym złotem przeciwciał. Bardzo wysoka czułość i specyficzność testów, minimalna wielkość próbek badawczych i w zasadzie możliwość wykorzystania prawie każdego rodzaju surowic to najważniejsze zalety tych technik.  – technika IEM dekoracji cząstek –  opracowana przez Milne i Luisoni w 1975 roku. Na skutek niespecyficznej adsorpcji cząstki wirusowe są unieruchamiane na powierzchni błonki podtrzymującej. Potraktowanie takich nieruchomych cząsteczek specyficzną surowicą prowadzi do wystąpienia reakcji serologicznej widocznej po kontrastowaniu w postaci opłaszczenia. Warstwa ta pochłania dużo więcej barwnika toteż jest widoczna jako ciemna otoczka. Poszczególne etapy procedury rozdzielone są dokładnym płukaniem siatek, dzięki czemu obrazy elektronomikroskopowe są bardzo wyraźne, dobrze wykontrastowane, bez nadmiaru zanieczyszczeń.

Antygeny i wirusy

grain-664740__180Efekt reakcji serologicznej między antygenem, czyli wirionami wirusa i specyficznymi przeciwciałami surowicy widoczny jest w mikroskopie elektronowym w postaci zlepionych przeciwciałami cząstek wirusów.  Pewne kłopoty natury technicznej w preparatyce jak: wysychanie mieszaniny serologicznej przed kontrastowaniem, krystaliczne osady po stosowanych buforach i często nieodpowiednie związki kontrastujące, powodowały, że z reguły uzyskiwano obrazy nieczytelne, z uszkodzonymi wirionami. Milne i Luisioni (1975,1977b) zaproponowali wersję tej techniki, wprowadzając etap płukania błonek podtrzymujących dzięki czemu uzyskiwano obrazy  dużo lepszej jakości. Wykorzystywano ją do identyfikacji wirusów, badań nad pokrewieństwem serologicznym oraz była polecana do mianowania surowic. Obecnie technika ta jest rzadko stosowana, gdyż efekty zbrylania cząstek są czasami niespecyficzne, koncentracja cząstek wirusów musi być stosunkowo wysoka i musi być odpowiednia koncentracja surowic.     3) Badania inkluzji wirusowych w ultracienkich skrawkach.   Patogeneza choroby wirusowej może pociągać za sobą  daleko idące zmiany w metabolizmie porażonych komórek roślin. Mogą być one związane z degradacją systemu elementarnych błon komórkowych, zmian strukturalnych organelli itp., co może doprowadzić nawet do śmierci komórki. Występują także zmiany cytologiczne, które mogą być specyficzne i typowe tylko dla rodziny lub rodzaju wirusa i są niezależne od reakcji rośliny żywicielskiej na zakażenie. Lesemann (1991) do takich zmian zalicza nagromadzenie się w komórce różnych produktów genomu wirusa oraz zmiany w systemie błon komórek żywiciela uczestniczących w procesie replikacji, które obserwowane mogą być jedynie krótko po infekcji. Główne produkty genomu wirusa to cząstki wirusów, występujące pojedynczo lub w agregatach oraz różne niestrukturalne białka tworzące duże i charakterystyczne inkluzje wirusowe. Cząstki wirusów, których genomem jest ssRNA, najczęściej występują w cytoplazmie podstawowej, ale także w centralnej wakuoli, plastydach lub mitochondriach. Wirusy o cząstkach izomerycznych najłatwiej rozróżnić, gdy tworzą zwarte masy lub kryształy. Wirusy o cząstkach wydłużonych mogą być obserwowane jako rozproszone masy cząstek, cząstki ułożone szeregowo i przylegające do błon elementarnych (poty-, carlawirusy) lub gdy występują w spłaszczonych, podobnych do płytek agregatach. Agregaty mogą się łączyć tworząc zwarte kryształy (tobamovirusy) lub ciała, inkluzje staśmione (potem-, Carla-, closterowirusy). Cytoplazmatyczne inkluzje wirusowe powstające z kodowanych przez genom wirusa białek niestrukturalnych to głównie ciała X wiązane z infekcją przez wirus mozaiki tytoniu i tobamowirusy oraz cylindryczne inkluzje charakterystyczne dla potywirusów. Funkcja, jaką mają spełniać inkluzje wirusowe, nie jest jeszcze poznana, może ich białko odgrywa jakąś rolę w systemie replikacyjnym RNA lub w transporcie wirusów z komórki do komórki. Edwardson i Christie w 1978 opisali charakterystyczne dla poszczególnych grup wirusów typy inkluzji wirusowych, które mogły być przydatne jako kryteria klasyfikacyjne (pokrewieństwo wirusów) i cechy diagnostyczne grupy.   Mikroskopia elektronowa dominowała w większości prac lat sześćdziesiątych. Lata siedemdziesiąte to dominacja enzymatycznego testu serologicznego ELISA, lata osiemdziesiąte należały do przeciwciał monoklinalnych, zaś w latach dziewięćdziesiątych zeszłego stulecia to fascynacja metodami łańcuchowej reakcji polimerazy – PCR. Zarówno nowe techniki EM, jak i coraz nowocześniejsze mikroskopy mogą odkryć przed nami nie jedną terra incognita mikroświata.