Surowica i techniki badania

fruit-607311__180Technika IEM preparatów in vitro wirusów roślin wykorzystywana jest głównie do identyfikacji wirusów, pomiarów miana surowic, określania pokrewieństwa serologicznego między wirusami, lokalizacji określonych determinant antygenowych na wirionach oraz zwiększania wielkości i kontrastu cząstek w celu ułatwienia identyfikacji wirusa.  – technika immunosorpcyjna ISEM oraz ISEM+dekoracja –  opracowana przez K. S. Derricka 1972/1973. Polega ona na serologicznym uczulaniu błonek podtrzymujących. Błonka zostaje pokryta warstwą przeciwciał surowicy i umieszczona na kropli zawiesiny wirusa. Uczulona błonka działa jak pułapka wyłapując z zawiesiny, w drodze reakcji serologicznej, prawie wyłącznie specyficzne antygeny, czyli cząstki wirusa. Dokonano wielu usprawnień tej techniki np. stosowaniem białka A, znakowaniem przeciwciał złotem koloidalnym czy stosowaniem przeciwciał monoklinalnych. Pokrycie siatki mikroskopowej surowicą umożliwia wyłapanie na siatkę wielokrotnie większej  – 2 do 30 tys. razy – liczby cząstek. Techniki te służą w diagnostyce wirusów występujących w tak małych koncentracjach, że nie mogą być wykrywane przy pomocy prostych technik negatywowego kontrastowania, np. luteowirusów. Techniką tą możliwe jest badanie serologicznego pokrewieństwa między wirusami i może ona służyć do oznaczeń ilościowych zarówno wirusów, jak i przeciwciał surowicy. Po zmieszaniu surowic można nią wykrywać mieszaniny wirusów. Wynik jak otrzymujemy jest jednoznaczny, bo obserwuje się bezpośrednio winiony, czułość techniki jest podobna jak technik enzymatycznych głównie ELISA. Warstwa surowicy nie dopuszcza do zanieczyszczenia błonki podtrzymującej białkiem rośliny, dzięki czemu cząstki są lepiej widoczne. Można wykorzystywać zarówno poli- jak i monoklinalne surowice. Trudności związane ze stosowaniem techniki ISEM to wysoki koszt wyposażenia i użytkowania pracowni elektronomikroskopowe, co wiąże się z ograniczeniem wielkości i liczebności badanych próbek. Połączenie techniki ISEM z dekoracją powoduje sumowanie zalet obu technik. Umożliwia też zastosowanie dwóch różnych rodzajów przeciwciał na poszczególnych etapach procedury, co bardzo ułatwia i podnosi czułość testów serologicznych w badaniach pokrewieństwa niektórych wirusów.  – technika zbrylania cząstek IEM – Pierwsze reakcje serologiczne obejrzano w mikroskopie elektronowym już w 1941 roku przez Andersona i Stanleya.

Identyfikacja wirusów roślin

vegetables-607307__180Identyfikacja wirusów roślin, a co za tym idzie i diagnozowanie choroby wirusowej możliwe są przy zastosowaniu metod roślin wskaźnikowych, metod serologicznych oraz technik elektronomikroskopowych.  W mikroskopie elektronowym ustala się przede wszystkim następujące cechy i własności wirusów: morfologię cząstek, ich właściwości serologiczne i pokrewieństwo z innymi wirusami oraz zmiany cytopatologiczne, jakie powstają na skutek porażenia danym wirusem. Do tego celu wykorzystuje się techniki do badań zawiesin wirusów w kontrastowych, negatywowo nieczyszczonych i oczyszczonych preparatach oraz techniki immunoelektronomikroskopowe. Umożliwiają one serologiczne wykrywanie wirusów występujących w bardzo niskich koncentracjach, wykrywanie mieszanin wirusów, a także przez możliwość mianowania surowic dokładnie określanie pokrewieństwa serologicznego. Specjalne znaczenie diagnostyczne mają wyniki badań interakcji wirus – roślina w ultracienkich skrawkach, a zwłaszcza badania inkluzji wirusowych.  1) Techniki elektronomikroskopowe w badaniach negatywowo kontrastowych preparatów in vitro wirusów roślin.   Preparaty in vitro wirusów to zawiesiny wirusów otrzymywane z soku roślin porażonych i te właśnie nadają się na preparaty elektronomikroskopowe. Aby cząstki wirusa były widoczne na błonce siateczki mikroskopu, muszą być wykontrastowane w stosunku do podłoża. W tym celu wykorzystywano techniki cieniowania, napylania wirionów ciężkimi metalami, które obecnie zastąpiono procedurami negatywowego kontrastowania preparatów. Tło staje się ciemniejsze a cząstki wirionów pozostają jaśniejsze. Do technik barwienia negatywowego preparatów in vitro należą:  – technika „mieszania EM” –  opracowana przez Williamsa i Backusa w 1949 roku. Polega ona na zmieszaniu preparatu zawierającego wirusa i barwnika w jednakowej objętości i pozostawieniu jej na siatce do wyschnięcia.  – technika zanurzania (dip) zwana zamiennie techniką szybkiego zanurzania (quick-dip) lub zanurzania liścia (leaf-dip) – opracowana przez Brandesa w 1957. Zasada techniki opiera się na tym, że krawędź świeżo przeciętego liścia lub fragment epidermy przeciągany jest kilka razy przez krople wody na szkiełku podstawowym. Część uszkodzonych komórek tonie w kropli, część pozostaje w postaci filmu na powierzchni kropli. Na kroplę nakłada się siateczkę i następnie kontrastuje. Technika ta przeznaczona była do wykrywania wirusów nitkowatych, ale Kitajima (1965), Hitchborn i Hills (1965) oraz Doi i wsp. (1969) wykrywali nią również izomeryczne winiony. Głównym problemem tej metody są zanieczyszczenia zaciemniające obrazy mikroskopowe.  technika zanurzania w soku (sap-dip) – technika ta wykorzystuje efekt adsorbowania cząstek wirusa na błonkach podtrzymujących. Błonki takie mogą być spłukiwane w celu usunięcia większości roślinnych zanieczyszczeń.