Surowica i techniki badania

fruit-607311__180Technika IEM preparatów in vitro wirusów roślin wykorzystywana jest głównie do identyfikacji wirusów, pomiarów miana surowic, określania pokrewieństwa serologicznego między wirusami, lokalizacji określonych determinant antygenowych na wirionach oraz zwiększania wielkości i kontrastu cząstek w celu ułatwienia identyfikacji wirusa.  – technika immunosorpcyjna ISEM oraz ISEM+dekoracja –  opracowana przez K. S. Derricka 1972/1973. Polega ona na serologicznym uczulaniu błonek podtrzymujących. Błonka zostaje pokryta warstwą przeciwciał surowicy i umieszczona na kropli zawiesiny wirusa. Uczulona błonka działa jak pułapka wyłapując z zawiesiny, w drodze reakcji serologicznej, prawie wyłącznie specyficzne antygeny, czyli cząstki wirusa. Dokonano wielu usprawnień tej techniki np. stosowaniem białka A, znakowaniem przeciwciał złotem koloidalnym czy stosowaniem przeciwciał monoklinalnych. Pokrycie siatki mikroskopowej surowicą umożliwia wyłapanie na siatkę wielokrotnie większej  – 2 do 30 tys. razy – liczby cząstek. Techniki te służą w diagnostyce wirusów występujących w tak małych koncentracjach, że nie mogą być wykrywane przy pomocy prostych technik negatywowego kontrastowania, np. luteowirusów. Techniką tą możliwe jest badanie serologicznego pokrewieństwa między wirusami i może ona służyć do oznaczeń ilościowych zarówno wirusów, jak i przeciwciał surowicy. Po zmieszaniu surowic można nią wykrywać mieszaniny wirusów. Wynik jak otrzymujemy jest jednoznaczny, bo obserwuje się bezpośrednio winiony, czułość techniki jest podobna jak technik enzymatycznych głównie ELISA. Warstwa surowicy nie dopuszcza do zanieczyszczenia błonki podtrzymującej białkiem rośliny, dzięki czemu cząstki są lepiej widoczne. Można wykorzystywać zarówno poli- jak i monoklinalne surowice. Trudności związane ze stosowaniem techniki ISEM to wysoki koszt wyposażenia i użytkowania pracowni elektronomikroskopowe, co wiąże się z ograniczeniem wielkości i liczebności badanych próbek. Połączenie techniki ISEM z dekoracją powoduje sumowanie zalet obu technik. Umożliwia też zastosowanie dwóch różnych rodzajów przeciwciał na poszczególnych etapach procedury, co bardzo ułatwia i podnosi czułość testów serologicznych w badaniach pokrewieństwa niektórych wirusów.  – technika zbrylania cząstek IEM – Pierwsze reakcje serologiczne obejrzano w mikroskopie elektronowym już w 1941 roku przez Andersona i Stanleya.

Nowoczesne wykrywanie wirusów

wheat-821976__180Jedną z najważniejszych i najistotniejszych zalet mikroskopii elektronowej jako metody badawczej określa sentencja widniejąca na transmisyjnym mikroskopie elektronowym w Departament of Plant Pathology Cornell University, USA – „zobaczyć, to znaczy uwierzyć”. W roku 1939 po raz pierwszy Kausche i wsp. obejrzeli cząstkę wirusa mozaiki tytoniu, od tamtej pory mikroskopia elektronowa (EM) na stałe weszła do zbioru technik badawczych stosowanych w wirusologii roślin. Chociaż w dzisiejszych czasach biologia molekularna dysponuje całym arsenałem specyficznych i bardzo czułych metod wykrywania wirusów, to jednak w wielu przypadkach właśnie techniki EM uważane są za jednoznaczne i ostatecznie dowodzące porażenia roślin przez wirusy, gdyż można te czynniki chorobotwórcze zobaczyć.  Identyfikacja wirusów w mikroskopie elektronowym i ustalenie ich przynależności  taksonomicznej są możliwe dzięki zastosowaniu technik immunoelektronomikroskopowych – IEM, służących do wykrywania reakcji serologicznych na poziomie pojedynczych cząstek wirusa jako antygenu i specyficznych przeciwciał surowicy. Pewną wartość diagnostyczną mają również niektóre charakterystyczne inkluzje wirusowe, które można stwierdzić w porażonych komórkach roślin, a także badania immunocytologiczne.  Techniki EM, w tym i techniki IEM, w badaniach negatywowo kontrastowych preparatów in vitro wirusów roślin mogą być wykorzystywane także do oceny czystości i jakości oczyszczonych preparatów wirusowych, jakości i specyficzności nowo wyprodukowanych surowic, wykrywania obecności mieszanych infekcji wirusami, wykrywania wirusów roślin w pojedynczych wektorach, a także służą do badań nad pokrewieństwem serologicznym wirusów. Techniki IEM są bardzo proste, szybkie i czułe lecz wymagają bardzo drogiej aparatury więc stosowane są dopiero wtedy, gdy inne techniki serologiczne zawodzą i wyniki testów są niepewne.

Identyfikacja wirusów roślin

vegetables-607307__180Identyfikacja wirusów roślin, a co za tym idzie i diagnozowanie choroby wirusowej możliwe są przy zastosowaniu metod roślin wskaźnikowych, metod serologicznych oraz technik elektronomikroskopowych.  W mikroskopie elektronowym ustala się przede wszystkim następujące cechy i własności wirusów: morfologię cząstek, ich właściwości serologiczne i pokrewieństwo z innymi wirusami oraz zmiany cytopatologiczne, jakie powstają na skutek porażenia danym wirusem. Do tego celu wykorzystuje się techniki do badań zawiesin wirusów w kontrastowych, negatywowo nieczyszczonych i oczyszczonych preparatach oraz techniki immunoelektronomikroskopowe. Umożliwiają one serologiczne wykrywanie wirusów występujących w bardzo niskich koncentracjach, wykrywanie mieszanin wirusów, a także przez możliwość mianowania surowic dokładnie określanie pokrewieństwa serologicznego. Specjalne znaczenie diagnostyczne mają wyniki badań interakcji wirus – roślina w ultracienkich skrawkach, a zwłaszcza badania inkluzji wirusowych.  1) Techniki elektronomikroskopowe w badaniach negatywowo kontrastowych preparatów in vitro wirusów roślin.   Preparaty in vitro wirusów to zawiesiny wirusów otrzymywane z soku roślin porażonych i te właśnie nadają się na preparaty elektronomikroskopowe. Aby cząstki wirusa były widoczne na błonce siateczki mikroskopu, muszą być wykontrastowane w stosunku do podłoża. W tym celu wykorzystywano techniki cieniowania, napylania wirionów ciężkimi metalami, które obecnie zastąpiono procedurami negatywowego kontrastowania preparatów. Tło staje się ciemniejsze a cząstki wirionów pozostają jaśniejsze. Do technik barwienia negatywowego preparatów in vitro należą:  – technika „mieszania EM” –  opracowana przez Williamsa i Backusa w 1949 roku. Polega ona na zmieszaniu preparatu zawierającego wirusa i barwnika w jednakowej objętości i pozostawieniu jej na siatce do wyschnięcia.  – technika zanurzania (dip) zwana zamiennie techniką szybkiego zanurzania (quick-dip) lub zanurzania liścia (leaf-dip) – opracowana przez Brandesa w 1957. Zasada techniki opiera się na tym, że krawędź świeżo przeciętego liścia lub fragment epidermy przeciągany jest kilka razy przez krople wody na szkiełku podstawowym. Część uszkodzonych komórek tonie w kropli, część pozostaje w postaci filmu na powierzchni kropli. Na kroplę nakłada się siateczkę i następnie kontrastuje. Technika ta przeznaczona była do wykrywania wirusów nitkowatych, ale Kitajima (1965), Hitchborn i Hills (1965) oraz Doi i wsp. (1969) wykrywali nią również izomeryczne winiony. Głównym problemem tej metody są zanieczyszczenia zaciemniające obrazy mikroskopowe.  technika zanurzania w soku (sap-dip) – technika ta wykorzystuje efekt adsorbowania cząstek wirusa na błonkach podtrzymujących. Błonki takie mogą być spłukiwane w celu usunięcia większości roślinnych zanieczyszczeń.

Preparaty antywirusowe

summer-861865__180Preparaty uzyskuje się przez nałożenie siateczki na krople soku lub odwrotnie po chwili spłukuje się ją wodą destylowaną i następnie kontrastuje. Zaleta metody jest to, że uzyskuje się wyraźniejsze obrazy morfologii cząsteczek, a wadą to, że jakiś ważny materiał może zostać wypłukany. Wykorzystując tę technikę Christie i wsp. (1987) opracowali procedurę CVC (clarifield viral concentrate) stosując wstępne oczyszczanie wirusa przed naniesieniem go na błonkę. Oprócz naprawdę czystych preparatów uzyskali, wielokrotne zwiększenie ilości cząstek wirusowych.  – technika „napięcia powierzchniowego” EM zwana „procedurą  rozszerzania” –  wykorzystuje napięcie powierzchniowe kropli wody, aby usunąć z preparatów sole i cukry czyli związki rozpuszczalne w wodzie. Białka i tłuszcze mogą pozostać na powierzchni kropli. Do powierzchni kropli dotyka się błonką siatki, a następnie kontrastuje. Służy ona w preparatyce kwasów nukleinowych  w ME. – technika „agarowa EM” – opisał ją  Kellenberger i Bitterli w 1976 roku. W technice tej błonkę podtrzymującą umieszcza się na płytce Petriego, a następnie nanosi się na nią zawiesinę wirusa. Drobne cząsteczki soli i cukrów powinny przeniknąć do agaru. Błonkę wypłukuję się barwnikiem z agaru i umieszcza na siatkach.    2) Techniki immunoelektronomikroskopowe preparatów in vitro.    Badanie reakcji serologicznych między antygenem (wirus roślinny) a specyficznymi przeciwciałami surowicy z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej możliwe jest dzięki tak zwanym technikom immunoelektronomikroskopowym – IEM. Techniki immunocytochemiczne umożliwiają lokalizację antygenów w komórkach roślin, za pomocą znakowanych elementarnym złotem przeciwciał. Bardzo wysoka czułość i specyficzność testów, minimalna wielkość próbek badawczych i w zasadzie możliwość wykorzystania prawie każdego rodzaju surowic to najważniejsze zalety tych technik.  – technika IEM dekoracji cząstek –  opracowana przez Milne i Luisoni w 1975 roku. Na skutek niespecyficznej adsorpcji cząstki wirusowe są unieruchamiane na powierzchni błonki podtrzymującej. Potraktowanie takich nieruchomych cząsteczek specyficzną surowicą prowadzi do wystąpienia reakcji serologicznej widocznej po kontrastowaniu w postaci opłaszczenia. Warstwa ta pochłania dużo więcej barwnika toteż jest widoczna jako ciemna otoczka. Poszczególne etapy procedury rozdzielone są dokładnym płukaniem siatek, dzięki czemu obrazy elektronomikroskopowe są bardzo wyraźne, dobrze wykontrastowane, bez nadmiaru zanieczyszczeń.